酶免疫技能对ELISA试剂盒试验的优势

ELISA试剂盒酶免疫技能是运用酶催化底物反响的生物扩大作用，进步特异性抗原-抗体免疫学反响检测敏感性的一种符号免疫技能。该技能所用的酶要求纯度高、催化反响的转化率高、专一性强、性质安稳、来源丰厚、价格不贵、制备成的酶标抗体或抗原性质安稳，继续保存着它的活性部分和催化才能。在受检标本中不存在与符号酶相同的酶。别的它的相应底物应易于制备和保存，价格低廉，有色产品易于测定，光吸收高。
一、酶和酶作用的底物
1.辣根过氧化酶（HRP）：HRP在蔬菜作物辣根中含量很高，纯化办法也不杂乱。它是一种糖蛋白，含糖量约18%；分子量为44kD；是一种复合酶，由主酶（酶蛋白）和辅基（亚铁血红素）结合而成的一种卟啉蛋白质。主酶为无色糖蛋白，在275nm波利益有zui高吸收峰；辅基是深棕色的含铁卟啉环，
在403nm波利益有zui高吸收峰。HRP对受氢体的专一性很高，除H202外，仅作用于小分子醇的过氧化物和尿素的过氧化物。后者为固体，作为试剂较H202便利。
许多化合物可作为HRP的供氧体，在ELISA中常用的供氢体底物为邻苯二胺（OPD）、四甲基联苯胺（TMB）和ABTS.OPD为在ELISA中运用zui多的底物，灵敏度高，比色便利。其缺陷是配成运用液后安稳性差，并且具有致异变性。TMB无此缺陷。TMB经酶作用后由无色变蓝色，目测比照明显；加酸中止酶反响后变，可在比色计中定量；因而运用日见增多。ABTS，虽然灵敏度不如0PD和TMB，但空白值很低。
2.碱性磷酸酶（AP）：ELISA试剂盒是从牛肠粘膜或大肠杆菌中提取。从大肠杆菌提取的AP分子量为80kD，酶作用的zui适pH为8.0；用小牛肠黏膜提取的AP分子量为l00kD，zui适pH为9.6.一般选用对**苯***（p-NPP）作为底物。它可制成片状试剂，运用便利。ELISA试剂盒产品为的对**酚，在405nm有吸收峰。用NaOH停止酶反响后，可安稳一段时间。
在ELISA中运用AP体系，其敏感性一般高于运用HRP体系，空白值也较低。但因为AP较难得到高纯度制剂，安稳性较HRP低，价格较HRP高，制备酶结合物时得率较HRP低一级原因，国内涵ELISA中一般均选用HRP.3.其他的酶：有葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶和脲酶等。β-半乳糖苷酸的底物常用4-甲基伞基-β-半乳糖苷，经酶水解后发作荧光物质4-甲基伞酮，可用荧光计检测。荧光的扩大作用大大进步了办法的敏感度。AP也可运用可发作荧光的伞基***作底物。其缺陷是需求荧光计测定，并且如用固相载体直接作为测定容器，此载体不行宣布荧光。脲酶的特色是酶作用后反响液发作pH改动，可使指示剂变色；别的，在人体内没有内源酶。
二、ELISA试剂盒酶符号抗体或抗原
酶符号的抗原或抗体称为结合物（conjugate）。抗原因为化学结构不同，可用不同的办法与酶结合，如为蛋白质抗原，基本上可参阅抗体酶符号的办法。制备抗体酶结合物的办法一般有以下几种。
1.戊二醛交联法：戊二醛是一种双功用团试剂，能够使酶与蛋白质或其他抗原的氨基通过它而偶联。戊二醛交联可用一步法（如衔接AP），也可用二步法（如衔接HRP）。戊二醛一步法操作简洁、有用，并且重复性好。缺陷是交联时分子间的比例不严厉，巨细也不一，影响作用。制备HRP抗体结合物也可用二步法，即先将HRP与戊二醛作用，透析除掉戊二醛，在pH9.5缓冲液中再与抗体作用而构成酶标抗体。此法的功率可高于一步法l0倍左右。
2.过碘酸盐氧化法：本法只用于HRP的交联。该酶含18%碳水化合物，过碘酸盐将其分子外表的多糖氧化为醛基。用***钠（NaBH4）中和剩余的过碘酸。酶上的醛根很生动，可与蛋白质结合，构成尔比例结合的酶标结合物。有人以为此法为辣根过氧化物酶交联zui有用的办法。但也有只以为因为所用试剂较为剧烈，各批试验成果不易重复。
按以上办法制备的结合物一般混有未结合的酶和抗体。理论上结合物中混有游离酶不影响ELISA中zui终的酶活性测定，因通过洗刷，非特异性吸附于固相上的游离酶已被洗去。但游离的抗体则会与酶标抗体竞赛相应的固相抗原，因而减低结合到固相上的酶标抗体量。因而制备的结合物应予以纯化。纯化的办法较多，别离大分子混合物的办法均可运用。硫酸铵盐析法操作简洁，但作用不如用sephadexg-200凝胶过滤的好。
3.符号抗体判定：ELISA试剂盒一般选用棋盘滴定法进行筛选，见第十九章。
三、ELISA试剂盒固相载体
酶免疫技能的首要试剂为固相的抗原或抗体、酶符号的抗原或抗体和与符号酶直接相关的酶反响底物。可作固相载体的物质许多，zui常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的功能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后保存本来的免疫活性。聚苯乙烯为塑料，可制成各种方式，在测定进程中，它作为载体和容器，不参加化学反响，加之它的价格低廉，所以被遍及选用。
聚苯乙烯载体的形状首要有三种：小试管、小珠和微量反响板。小试管的特色是还能兼作反响的容器，zui终放入分光光度计中比色。小珠一般为直径0.6cm的圆球，外表经磨砂处理后吸附面积大添加。如用特别的洗刷器，在洗刷进程中使圆珠滚动淋洗，作用更好。zui常用的载体为微量反响板，于ELISA测定的产品也称为ELISA板，用的规范板形是8×12的96孔式。为便于作少数标本的检测，有制成8联或l2联孔条的，放入座架后，巨细与规范ELISA板相同。ELISA板的特色是能够一起进行很多标本的检测，并可在特定的比色计上敏捷读出成果。现在已有多种自动化仪器用于微量反响板型的ELISA检测，包含加样、洗刷、保温、比色等进程，对操作的规范化极为有利。
杰出的ELISA板应该是吸附功能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间和同一板各孔之间功能相近。聚苯乙烯ELISA板因为配料的不同和制造工艺的不同，各种产品的质量差异很大。因而每一批号的聚苯乙烯制品在运用前须查看其功能。常用的查看办法为：以必定浓度的人IgG（一般为10ng／ml）包被ELISA板各孔后，每孔内参加恰当稀释的酶标抗人IgG抗体，保温后洗刷，加底物显色，停止酶反响后别离测每孔溶液的吸光度。操控反响条件，使各读数在0.8左右。计算一切读数的均匀值。一切单个读数与均匀读数之差应小于10%.与聚苯乙烯相似的塑料为聚氯乙烯。作为ELISA固相载体，聚氯乙烯板的特色为质软板薄，可切开，价廉、但光洁度不如聚苯乙烯板。聚氯乙烯对蛋白质的吸附功能比聚苯乙烯高，但空白值有时也略高。
为比较不同固相在某一ELISA测定中的好坏，可用以下办法加以查验：用其他免疫学测定办法选出一个典型的阳性标本和一个典型的阴性标本。将它们别离进行一系列稀释后，在不同的固相载体上按预订的ELISA操作进程进行测定，然后比较测定成果。在哪一种载体上阳性成果与阴性成果判别zui大，这种载体就是这一ELISA测定的zui合适的固相载体。
除塑料制品外，固相酶免疫测定的载体还有两种资料：一是微孔滤膜，如**纤维素膜、尼龙膜等，这类测定方式将在本章“膜载体的酶免疫测定"中介绍。另一种载体是以含铁的磁性微粒制造的，反响时固相微粒悬浮在溶液中，具有液相反响的速率，反响完毕后用磁铁招引作为别离的手法，洗刷也非常便利，但需配备特别的仪器。
四、免疫吸附剂
ELISA试剂盒固相的抗原或抗体称为免疫吸附剂。ELISA试剂盒将抗原或抗体固相化的进程称为包被。因为载体的不同，包被的办法也不同。如以聚苯乙烯ELISA板为载体，一般将抗原或抗体溶于缓冲液（zui常用的为pH9.6的碳酸缓冲液）中，加于ELISA试剂盒ELISA板孔中在4℃夜，经清洗后即可运用。如果包被液中的蛋白质浓度过低，固相载体外表有能被此蛋白质*掩盖，ELISA试剂盒其后参加的血清标本和酶结合物中的蛋白质也会部分地吸附于固相载体外表，zui终发作非特异性显色而导致本底偏高。在这种情况下，如在包被后再用1%～5%牛血清白蛋白包被一次，能够消除这种干扰。这一进程称为关闭（blocking）。包被好的ELISA板在低温可放置一段时间而不失掉其免疫活性。