公司对葡萄糖-6-磷酸酶染色液（铅法）操作方法

产品简介：
葡萄糖-6-磷酸酶染色液是一种多存在于哺乳类动物肝、肾、肠等组织的膜结合酶，G-6-Pase 和微体紧密结合，定位于内质网，是内质网的主要标志酶，能把葡萄糖-6-磷酸水解成葡萄糖和磷酸。G-6-Pase 对维持血糖浓度的相对恒定有至关重要的作用，是糖代谢的关键酶。当血糖降低时，G-6-Pase 促进肝糖原转变为血糖。当缺乏G-6-Pase 时，会引起糖原分解障碍，使糖原积累在肝、肾、心脏等部位，导致肝糖原储积病。G-6-Pase zui适pH 为6.5，在pH6.0～8.0 亦可，pH8.0 zui稳定，pH5.0易变性。组织化学反应多用pH6.5～6.7。
葡萄糖-6-磷酸酶染色液(铅法)采用重金属捕捉剂和磷酸结合显示酶的活性。该酶对固定很敏感，组织经80%乙酸溶液固定后用石蜡包埋，G-6-Pase *被抑制。需用新鲜组织低温恒冷切片，经甲醛短时固定酶即失活，但可短时低温丙酮固定，但一般不固定。
操作步骤(仅供参考)：
1、冰冻切片入蒸馏水清洗。
2、入G-6-Pase 孵育液，37℃孵育15～20min。
3、自来水冲洗后，蒸馏水冲洗。
4、在上述过程中配制ALP 硫化工作液，即取试剂(B)用蒸馏水稀释50 倍, 即为ALP 硫化工作液，即配即用。切片入硫化工作液，孵育1min。
5、自来水水洗3～5min。
6、(可选)入中性福尔马林，固定2min。
7、入蒸馏水水洗2 次。
8、甘油明胶封片

铅法：葡萄糖-6-磷酸水解后所释放出磷酸，为*所捕获，经硫化铵处理，zui终反应产物为颗粒状的硫化铅沉淀。反应通式如下：
 
葡萄糖―6―磷酸钠+H2 O 葡萄糖 -6- 磷酸酶 葡萄糖+磷酸 Pb(NO3 )2 Pb3 (PO4 )2  (NH4 )2 S PbS↓
 
 1)孵育液配制(新鲜配制)
  0．125％葡萄糖―6―磷酸钠                       4ml
  0．2mol/LTris-顺丁烯二酸盐缓冲液(pH 7．4)       4ml
  2％Ph(N03 )2 (2．5％)                              0.6ml
  蒸馏水                                          1．4ml
  充分混合后使用
 
    2)染色程序：
    ①新鲜组织冰冻切片；
    ②10％福尔马林固定5分钟后水洗；
    ③切片入孵育液中，37℃孵育20分钟水洗；
    ④人1％硫化铵水溶液中1分钟水冲洗；
    ⑤3％福尔马林后固定10分钟；
    ⑥甘油明胶封固。
 
    3)结果：酶活性处显棕色。
 
    4)对照实验：①除去底物；②以F―甘油磷酸钠代替底物；③以0．01mol/L氟化钠作为抑制剂。